Інноваційна технологія ExIGS об'єднала методи мікроскопії та секвенування ДНК.

Дослідники з Гарварду розробили ExIGS -- метод, що одночасно секвенує ДНК та візуалізує білки в клітинах на нанорівні

Дослідники з Гарвардського університету в Інституті Броуда повідомили про розробку революційної технології під назвою розширене секвенування геному на місці (ExIGS), яка дозволяє одночасно секвенувати ДНК та візуалізувати білки на нанорівні в окремих клітинах. Результати дослідження, опубліковані в журналі Science, демонструють, як ядерні аномалії пов'язані з осередками аберантної регуляції хроматину, що потенційно може призводити до втрати клітинної ідентичності.

Під мікроскопом клітини можна розпізнати за їх розмірами, формою, структурними особливостями та зовнішнім виглядом органел. Особливу важливість у патології має морфологія ядра, оскільки аномалії у формі ядра або текстурі хроматину можуть свідчити про механістичні порушення, які часто є показниками для діагностики раку та захворювань крові. Геномне секвенування перенесло акцент на аналіз епігеномних, транскриптомних та протеомних показників для виявлення різновидів і станів клітин, що дає змогу дослідникам заглиблюватися у можливі причини морфологічних змін при захворюваннях.

Мікроскопія дозволяє спостерігати результати неспрацьованого механізму, проте надає обмежену інформацію про причинно-наслідкові зв'язки. Секвенування здатне виявити генетичні основи змін, однак йому бракує тканинно-специфічного контексту в середовищі клітин. Нещодавні технології просторової геноміки, такі як ExIGS, почали поєднувати мікроскопічні методи з секвенуванням, що дозволяє картографувати транскриптоми в тканинах на рівні окремих клітин.

У дослідженні, яке отримало назву "Розширене секвенування геному на місці: зв'язок ядерних аномалій із аномальною регуляцією хроматину", вчені представили новий метод ExIGS. Цей підхід дозволяє проводити секвенування геномної ДНК та визначати розташування ядерних білків з нанометровою роздільною здатністю в індивідуальних клітинах.

ExIGS провела аналіз 63 здорових шкірних фібробластів для оцінки приросту даних після їх розширення, а також 109 легень фібробластів з популярної клітинної лінії, з візуалізацією маркерів ядерної оболонки та хроматину. У дослідженні також використовувалися 196 ядер, отриманих від фібробластів пацієнта з прогерією, поряд із 63 ядрами від здорових контрольних зразків.

Зразки прогерії були вибрані через те, що це захворювання спричиняє прискорене старіння ядер клітин внаслідок аномального білка ламін, а порушення в таких клітинах добре вивчені в контексті патології. Для порівняння старіння були використані тканини серця мишей та фібробласти, отримані від 92-річного донора.

На початковому етапі відбувся двоступеневий процес фіксації зразків, що дозволив зберегти як геномну ДНК, так і білки в полімерній матриці, що розширюється. На наступному етапі використання методу котячого кола призвело до створення клональних нанокуль у гелі. Ці нанокулі ампліконів були вилучені та секвеновані на стандартній платформі Illumina. На фінальному етапі мультимодальні дані були об'єднані за допомогою комп'ютерного конвейера, що дозволило визначити, яка ДНК була виявлена в конкретних ділянках розширеної клітини.

За допомогою ExIGS з використанням розширених зразків було досягнуто більш ніж десятикратного збільшення кількості зчитувань ДНК на ядро, при цьому зберігаючи тривимірну структуру. Близько 33,6% зчитувань були зафіксовані в радіусі 200 нанометрів від ядерних білків. Ділянки ДНК, що розташовані поблизу ядерної оболонки (ламіну), виявилися менш активними, тоді як області, що знаходяться поруч з ядерними плямами, виявили більш високу активність.

У клітинах пацієнтів з прогерією спостерігалося потовщення ядерної оболонки, яка почала заглиблюватися, формуючи маленькі області, де активна ДНК опинялася близько до оболонки та виглядала пригніченою. В нормальних, а також у старих клітинах і клітинах серця мишей ферменти, що відповідають за зчитування генетичної інформації, виявлялися рідкісними в радіусі 200 нанометрів від складок ламін, що свідчить про те, що ці складки гальмують активність сусідніх генів.

Автори роблять висновок, що організація ламіну діє як ключовий контролер генної активності, з аномальними складками ламіну, що створюють кишені замовченої ДНК, які можуть спричиняти клітинну дисфункцію при старінні та захворюваннях. ExIGS пропонує потужний новий спосіб картування того, як ядерна структура впливає на функцію геному, дозволяючи дослідження розладів, таких як прогерія, серцево-судинні захворювання та нормальне старіння.

Технологія ExIGS представляє значний прорив у галузі клітинної біології та медицини, оскільки вперше дозволяє дослідникам одночасно спостерігати структурні зміни в клітинах та розуміти їх геномні причини. Це особливо важливо для вивчення процесів старіння та розвитку захворювань, коли морфологічні зміни клітин можуть передувати клінічним симптомам.

Дослідження виявило, що у здорових клітинах генетичний матеріал має чітко структуровану просторову організацію: активні гени розміщені далі від ядерної мембрани, тоді як неактивні знаходяться ближче до неї. Однак при патологічних умовах, як-от прогерія, ця організація порушується через деформацію ядерної оболонки, що призводить до неправильного розташування активних генів і їх придушення.

Метод ExIGS складається з трьох ключових етапів. Перш за все, клітини фіксуються в унікальній полімерній матриці, яка зберігає як ДНК, так і білкові компоненти. Наступним кроком є ампліфікація ДНК безпосередньо в тканині, що дозволяє отримати мільйони копій кожного фрагмента у формі нанокуль. На завершальному етапі ці нанокулі підлягають секвенуванню, а отримані результати поєднуються з мікроскопічними зображеннями для формування просторової карти геному.

Результати дослідження клітин пацієнтів, які страждають на прогерію - рідкісне генетичне захворювання, що призводить до прискореного старіння, виявилися особливо цікавими. У цих клітинах вчені зафіксували характерні деформації ядерної оболонки, які формували "кишені" з пригнобленою генетичною активністю. Аналогічні, хоча й менш виражені, зміни були виявлені в клітинах літніх донорів, що підтверджує зв'язок між структурними змінами в ядрі та процесами старіння.

Технологія також дозволила виявити роль ядерних плям -- спеціалізованих структур, де відбувається обробка РНК. Виявилося, що гени, розташовані поблизу цих структур, мають підвищену активність, що підтверджує важливість просторової організації ядра для регуляції генної експресії.

Потенційні застосування ExIGS виходять далеко за межі дослідження старіння. Технологія може бути використана для вивчення розвитку раку, коли зміни в ядерній морфології є одними з перших ознак злоякісної трансформації. Також вона може допомогти в розумінні механізмів дії різних лікарських препаратів на клітинному рівні та розробці нових терапевтичних підходів.